LAMP法快速可视化检测水稻高直链淀粉基因Wxa

岱安其，梁祥帅，叶文伟，王和飞，吴先军2*，田永航1*

1. 海南热带海洋学院食品科学与工程学院    2. 四川农业大学水稻研究所

 农业生物技术学报，2023,31（6）:1325-1332

https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7ioT0BO4yQ4m_mOgeS2ml3UD27inV96hFDJsfwOZw0vBnwUOY2rW8Oy3PHa1ChgUFb&uniplatform=NZKPT

摘要：

挖掘和利用高直链淀粉基因颗粒结合型淀粉合成酶(waxy, Wx)的等位变异Wx^a是当前水稻(Oryza sativa)育种的热点之一，而便捷地筛选基因Wx^a是关键。本研究设计水稻高直链淀粉基因Wx^a的可视化环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)功能标记，探索便捷的筛选方法。首先通过序列比对，找出Wx^a基因的Ex10-115(T/C)变异位点及上下游一致性序列作为目标序列。然后用Primer3 Input、NEBcutter V2.0和PrimerExplore V5等软件，在目标序列上设计用于基因型鉴定的酶切扩增多态性标记(cleaved amplified polymorphic sequences, CAPs)和LAMP标记，最后对标记的可视化检测进行测试。结果显示，在Ex10-115(T/C)变异位点附近有保守序列，据此设计出了CAPs标记(Wx^a-2F和Wx^a-2R)和LAMP标记(F3, B3, FIP和BIP)。用CAPs标记对10个水稻品种进行检测，结果显示，’D62B’、’G46B’、’Ⅱ-32B’、’ZS97B’和’GLA4’等品种携带Wx^a基因，直链淀粉含量也较高，而其他5个品种不携带Wx^a基因，基因型与表型一致。用LAMP标记结合显色剂羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue, HNB),63℃恒温反应60 min，裸眼可观察水稻品种是否携带Wx^a基因，与CAPs标记的检测结果一致。本研究设计了筛选水稻Wx^a基因的便捷方法，研究结果可为水稻其他重要基因的功能标记开发及应用提供参考。

关键词：高直链淀粉基因；酶切扩增多态性标记(CAPs)；环介导恒温扩增(LAMP)；可视化；功能标记