PBJ | 扬州大学梁国华/周勇等报道通过编辑SLG7基因启动子改善稻米外观品质

来源：植物科学最前沿

近日，扬州大学梁国华/周勇团队联合上海市农业科学院吴书俊团队在国际生物技术著名期刊Plant Biotechnology Journal上在线发表题为“Rapid production of novel beneficial alleles for improving rice appearance quality by targeting a SLG7 promoter regulatory element”的研究论文。该研究通过CRISPR/Cas9技术编辑水稻细长粒型主效QTL SLG7启动子的关键调控元件，提高SLG7基因表达，创制可增加籽粒长宽比、减少垩白的新等位变异，为水稻外观品质的快速改良提供了新策略。

水稻品质性状主要包括外观品质、碾磨加工品质、蒸煮食味品质和营养功能品质。垩白是稻米胚乳中白色不透明部分，不仅影响稻米外观品质，而且也影响加工和蒸煮食味品质，垩白高会显著降低稻米市场价值。目前，减少垩白是稻米外观品质改良的主要方向之一。粒长与垩白显著负相关，导入长粒基因、适当提高长宽比被认为是减少垩白的有效途径。梁国华/周勇团队于2015年克隆了一个控制水稻细长粒型的主效QTL，命名为Slender grain on chromosome 7 (SLG7)，与GL7/GW7基因等位。表达量高的等位基因可增加籽粒长宽比，降低水稻垩白，但对粒重和产量没有明显影响，可用于水稻产量和品质的协同改良。然而，利用传统方法导入SLG7有利等位基因需要多年的杂交与回交，过程耗时费力。

基因编辑技术的开发和应用为作物分子设计育种带来了革命性变化。利用CRISPR/Cas9技术对启动子区域进行编辑，可以在转录层面对基因的表达进行精细调控，创制新的优异等位变异。在该研究中，作者分析了SLG7启动子的调控元件，发现不仅包括前人报道的OsSPL16结合位点“GTAC”，还包括ATC-motif、ACII等其它调控元件。作者在这些潜在调控元件附近选择了5个靶位点（T1-T5）进行基因组编辑，希望获得这些元件发生变异的突变体。测序分析表明，在粳稻武运粳30（WYJ30）背景下，5个靶位点均获得了不同类型的纯合突变体，其中T1、T2、T4和T5靶位点的突变体均是1个或2个碱基的变异，而T3靶位点的3个突变体（WYJ30-T3-1、WYJ30-T3-2、WYJ30-T3-3）均是小片段缺失或者替换。表达分析表明，WYJ30-T3突变体中SLG7表达量显著高于野生型，粒型变细长，而其余4个靶位点的突变体与野生型相比均无明显差异。随着籽粒长宽比的增加，WYJ30-T3突变体的垩白粒率和垩白度明显下降。

为了解析T3靶位点变异影响SLG7表达的分子机制，作者将水稻中已克隆的多个调控粒型的转录因子分别与SLG7启动子进行酵母单杂交互作分析。发现MYB转录因子AH2可以与WYJ30的SLG7启动子结合，这与Ren等人的结果相一致（Plant J, 2019, 100: 813–824）。AH2与WYJ30-T3-1中突变的SLG7启动子结合能力变弱，且不能与WYJ30-T3-2和WYJ30-T3-3中突变的启动子结合。T3靶位点附近有一个ACII元件，利用EMSA进一步证明了AH2蛋白能够与包含ACII元件的启动子片段结合；而ACII元件突变后，AH2则不能与其结合。说明ACⅡ是影响AH2与SLG7启动子结合的重要调控元件。作者进一步分析了AH2蛋白与WYJ30-T3突变体启动子的结合能力，发现当以WYJ30-T3中突变的启动子片段作为竞争性探针，对AH2与生物素标记探针结合的竞争能力有不同程度的减弱。双荧光素酶（LUC）分析表明，AH2蛋白抑制WYJ30中SLG7启动子表达，但AH2对WYJ30-T3突变体启动子表达的抑制作用也有不同程度的减弱。另外，SLG7在ah2突变体中的表达明显提高。作者同时注意到WYJ30-T3-1和WYJ30-T3-2突变体中的启动子仍含有ACII元件，推测ACII元件附近的序列在体内可能也会影响AH2与ACII元件的结合。将T3靶位点的载体转入另外一个粳稻品种盐稻8号中，作者也获得了垩白明显下降的株系，说明该方法可广泛用于水稻外观品质的快速改良。

以上研究表明，AH2可与SLG7启动子结合并抑制其表达，利用基因编辑手段敲除ACII元件或附近的启动子片段会导致AH2与SLG7启动子的结合能力减弱，提高SLG7表达水平，增加籽粒长宽比、减低稻米垩白。以上研究进一步揭示了SLG7的遗传调控网络，探索了通过对SLG7启动子关键调控元件的编辑快速改良稻米外观品质的分子育种策略。

扬州大学农学院博士生谭文琛和青年教师缪军为论文的共同第一作者，扬州大学农学院周勇教授、梁国华研究员和上海市农业科学院吴书俊研究员为共同通讯作者。中国水稻研究所任德勇研究员提供了ah2突变体用于基因表达的验证。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、江苏省自然科学基金等项目资助。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14041