定向突变水稻基因新技术——CRISPR/Cas系统

长期以来，科学家们一直想按照人类的设计定点改造特定基因以提高水稻的产量和质量，但定点基因改造技术在水稻等植物中一直没有突破。

2014年，朱健康领导研究小组发表文章The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation称，他们测试了2个水稻亚种（粳稻日本晴和籼稻Kasalath）11个靶基因中CRISPR/Cas9诱导产生突变的效率、特点、遗传性及特异性等。对T0代转基因植株的检测表明，CRISPR/Cas9系统在所有11个靶基因位点都诱导产生了突变，突变效率高达66.7%，且超过一半（6/11）的靶基因位点在T0代获得纯合突变体。同时研究表明，CRISPR/Cas9诱导产生的基因突变在后代的遗传传递符合经典的孟德尔定律。对CRISPR/Cas9系统产生的突变类型分析表明，单碱基的突变类型超过70%，且大部分（53.9%）为单碱基的插入；超过10个碱基的突变类型仅为3.7%。通过全基因组重测序及检测与靶序列高度同源的序列，研究小组仅在只有一个碱基不同的潜在脱靶位点检测到突变，这表明CRISPR/Cas9系统在水稻中有很高的特异性。该研究表明CRISPR/Cas9系统可实现对水稻特定基因的高效、可稳定遗传的及特异性的定点突变。该研究于2014年5月23日在线发表于国际学术期刊Plant Biotechnology Journal杂志上，7月17日被选为该杂志第12卷第6期的封面文章。

2013年，北京大学生命科学学院的瞿礼嘉教授实验室也利用最新的CRISPR-Cas系统成功地实现了对水稻特定基因的定点突变，效率达到80%以上。这一研究成果公布在Cell Research杂志上。瞿礼嘉教授实验室通过密码子优化技术使Cas9适于在水稻中表达，并且采用了强启动子驱动其表达。他们选定两个基因进行CRISPR-Cas定点突变，这两个基因分别是水稻叶绿素合成基因CAO1和分蘖夹角控制基因LAZY，结果表明，有83.3%的第一代转基因植株中CAO1基因相应位点发生了突变，而有高达91.6%的转基因植株中LAZY基因相应位点发生了突变，其中LAZY基因的突变纯合体的比例达到50%，均表现出分蘖夹角变大的表型，这说明利用CRISPR-Cas系统可实现对水稻特定基因的高效定点突变。

CRISPR/Cas系统，为目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。目前已发现三种不同类型的CRISPR/Cas系统，存在于大约40%和90%已测序的细菌和古菌中。其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心的组成。该机制由丹尼斯克公司的科学家于2007年发现的，很快受到很多领域科学家的重视，因为它具备非常有价值的特性：以特定的基因序列为靶向目标。CRISPR-Cas系统在今年早些时候已被成功地用于在人、小鼠、斑马鱼、果蝇等模式动物中定点突变基因。

CRISPR的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA双元复合体，此复合体引导内切酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的单个sgRNA(single-guide RNA)，足以引导Cas9内切酶对DNA的定点切割。DNA双链发生断裂后，其在修复的过程中可实现定点插入、缺失、突变或修饰。

CRISPR-Cas定点基因突变技术可大大加快水稻功能基因组的研究，进而加快培育高产、高抗和优质的水稻品种，提高水稻的产量和品质。

参考文献：

1、 Hui Zhang1, Jinshan Zhang1,2, Pengliang Wei1,2, Botao Zhang1, Feng Gou1,2, Zhengyan Feng1,2,3, Yanfei Mao1, Lan Yang1, Heng Zhang1, Nanfei Xu1,* andJian-Kang Zhu1,4,*,The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation,Plant Biotechnology Journal,Article first published online: 23 MAY 2014, DOI: 10.1111/pbi.12200

2、 Feng Z1, Zhang B, Ding W, Liu X, Yang DL, Wei P, Cao F, Zhu S, Zhang F, Mao Y, Zhu JK. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Res. 2013 Oct;23(10):1229-32. doi: 10.1038/cr.2013.114. Epub 2013 Aug 20.

3、 Hsu PD , Lander ES , Zhang F .Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell 2014 Jun;157 (6): 1262-1278.（综述，免费全文）