实验新方法：测定水稻幼苗硝酸盐吸收及转运活性

¹⁵N是一种稳定的非放射性元素，可利用GC/MS（Gas Chromatography/Mass Spectrometry）进行精确测定。植物中通常用¹⁵N 标记方法测定 N 元素吸收。利用¹⁵N-KNO₃ 处理植物，当植物吸收 ¹⁵NO₃‑ 后，对不同植物组织取材、烘干并研磨，就可以测定不同组织¹⁵N 含量，用以计算¹⁵NO₃‑含量，进而计算出植物地上和地下部分硝酸盐吸收活性及转运速率，并进一步确定硝酸盐净吸收及转运活性。这种方法在水稻和拟南芥中同样适用。

中国科学院遗传与发育生物学研究所储成才课题组主要以水稻为研究材料，开展农作物营养高效吸收利用的分子机制解析研究，通过分子设计实现农作物品种的定向改良。2015年课题组克隆到一个编码硝酸盐转运蛋白基因 NRT1.1B/OsNPF6.5，该基因在籼稻和粳稻间呈现显著分化，即籼稻型 NRT1.1B 比粳稻型有更高的硝酸盐吸收效率。在该研究中，用¹⁵N 标记的 15N-KN O₃ 处理水稻幼苗可用于检测硝酸盐的吸收活性及转运速率。相关的实验流程以¹⁵N -nitrate Uptake Activity and Root-to-shoot Transport Assay in Rice 为题发表在 Bio-Protocol 杂志（https://bio-protocol.org/e1897）。

研究人员利用改良的木村营养液（modified Kimura B solution）培养水稻幼苗。主要改良是用 5 mM KNO₃ 作为唯一氮源，Ca(NO₃)₂ 用等浓度 CaCl₂ 代替。如图1所示，把露白的水稻种子播种在剪去底部的96孔PCR板上，然后用灭菌水培养三天，等根伸长至3-5厘米时改用木村营养液培养幼苗，每天固定时间换一次营养液，两周左右即可进行¹⁵N吸收实验。

做吸收实验当天，先在固定时间换营养液，进行大约2小时的预处理。2小时后再换含有 5 mM ¹⁵N -KNO₃ 的木村营养液（其他组分不变，把原来的 KNO₃ 换成等浓度的¹⁵N -KNO₃）进行吸收实验。吸收3小时后分不同组织取材。

组织烘干并充分研磨后，即可进行¹⁵N含量测定。根据地上和地下部分的15N 含量可计算硝酸盐吸收活性及转运速率。

需要注意的是，等根伸长到3-5厘米时再换营养液。预处理的作用是确保水稻幼苗在¹⁵N -KNO₃处理前有一个正常的生理状态。

¹⁵N标记的硝酸盐已被用于许多植物的硝酸盐吸收活性及转运速率测定。本文旨在以水稻幼苗为例进行介绍。读者可以在 Bio-protocol 找到该方法完整的实验和数据计算流程。

参考文献：

1.Delhon, P., Gojon, A., Tillard, P. and Passama, L. (1995). Diurnal Regulation of No3- Uptake in Soybean Plants .1. Changes in No3- Influx, Efflux, and N Utilization in the Plant during the Day-Night Cycle. Journal of Experimental Botany 46(291): 1585-1594.

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3.Lin, S. H., Kuo, H. F., Canivenc, G., Lin, C. S., Lepetit, M., Hsu, P. K., Tillard, P., Lin, H. L., Wang, Y. Y., Tsai, C. B., Gojon, A. and Tsay, Y. F. (2008). Mutation of the Arabidopsis NRT1.5 Nitrate Transporter Causes Defective Root-to-Shoot Nitrate Transport. Plant Cell 20(9): 2514-2528.